前沿进展：ATP与水解自由能对细胞内双稳态开关的调控机制
导语
活细胞需要维持在热力学非平衡态，通过不断耗散能量（例如ATP水解自由能Δμ）来驱动生物过程和生物功能。在具体的细胞调控网络和生命活动中，不同网络结构如何影响Δμ对生物功能（动力学行为）的调控作用？2024年7月11日，北京大学物理学院/定量生物学中心欧阳颀/李方廷团队在美国物理学会（APS）旗下期刊 Physical Review Research 发表研究论文，揭示了细胞内双稳态开关中，调控网络结构对细胞内ATP水平和Δμ调控双稳态性质的影响。
研究领域：非平衡态热力学，生物物理，细胞调控网络，细胞双稳态
李典杰、庞清宇、李方廷 | 作者
论文题目：Interplay between ATP and hydrolysis free energy in promoting and restraining biochemical switches
论文链接：https://journals.aps.org/prresearch/abstract/10.1103/PhysRevResearch.6.033050
活细胞是远离热力学平衡态的开放系统，需要不断地与外部环境交换物质、信息和能量，来维持生命活动的有序性[1, 2]。细胞调控网络产生的多种动力学行为，在细胞增殖、分化和代谢等生物过程中发挥着重要作用，实现不同生物功能[3]。同时，活细胞需要维持在热力学非平衡态，通过不断耗散能量（例如ATP水解自由能Δ_μ_）来驱动生物过程和生物功能[2, 4]。前人研究已经揭示了实现不同生物功能所需的基本网络，也发现了ATP水解自由能Δ_μ_对特定生物功能和动力学行为的影响[2-4]。然而，在具体的细胞调控网络和生命活动中，不同网络结构是如何影响Δ_μ_对生物功能（动力学行为）的调控作用？
2024年7月11日，北京大学物理学院/定量生物学中心欧阳颀/李方廷团队在美国物理学会（APS）旗下期刊_Physical Review Research_发表了题为“Interplay between ATP and hydrolysis free energy in promoting and restraining biochemical switches”（DOI: 10.1103/PhysRevResearch.6.033050）的研究论文，揭示了细胞内双稳态开关中，调控网络结构对细胞内ATP水平和Δ_μ_调控双稳态性质的影响。
细胞内双稳态开关具有迟滞响应的特性，即从低态向高态跳转和从高态向低态跳转的触发阈值不同[3]。因此，利用双稳态行为构建的开关（双稳态开关）具备超敏响应特性和抗噪能力，在信号传导和细胞周期调控中发挥着关键作用[4]。在酵母细胞周期中，调控网络通过关键蛋白的磷酸化-去磷酸化循环（Phosphorylation-dephosphorylation cycle，PdP cycle），结合正反馈调控，构成了多个双稳态开关。这些双稳态开关的功能依赖于PdP循环的驱动力—ATP水解自由能Δ_μ_[4]。Δ_μ_的定义为Δ_μ_ = kBT ln{Keq[ATP]/([ADP][Pi])}，其中Keq是ATP水解反应的平衡常数，[ATP]、[ADP]和[Pi]分别代表ATP、ADP和Pi在细胞中的浓度。
课题组前期研究表明，对于细胞周期中两个重要过程的双稳态开关，细胞内ATP浓度（[ATP]）和Δ_μ_的作用机制不同（图1）[5, 6]。在芽殖酵母细胞周期的DNA复制检查点中，存在由单个PdP循环构成、包含正反馈的的双稳态开关（图1a）。当系统处于双稳态区域且在低稳态状态下，增加Δ_μ_会降低系统从低态往高态跳转的[ATP]阈值（双稳区右边界斜率为负）。这说明Δ_μ_降低了打开开关所需的[ATP]阈值，表明Δ_μ_和[ATP]协同调控开关的打开；同样，因为双稳区左边界也为负斜率，Δ_μ_和[ATP]也协同调控双稳态开关关闭过程（图1b-c）。而在裂殖酵母细胞周期的G2-M转换过程中，调控网络通过多个PdP循环和正反馈调控，构建了双稳态开关。不同于DNA复制检查点的双稳态开关，[ATP]和Δ_μ_在G2-M转换过程的双稳态开关中存在竞争效应（双稳区右边界斜率为正），即当Δμ提高时，[ATP]激活G2-M转换的阈值也升高了（图1d-f）。
图1. 酵母细胞中DNA复制检查点和G2-M转换过程的磷酸化-去磷酸化循环网络[5, 6]。（a-c）芽殖酵母DNA复制检查点通路的反应网络（a）、双稳态特性（b）和ATP-Δμ相图（c）。（d-f）裂殖酵母细胞周期中G2-M转换过程的调控网络（d）、双稳态特性（e）和ATP-Δμ相图（f）。
基于此，研究者针对以下3个问题开展研究：（1）[ATP]和Δ_μ_在不同双稳态开关中的作用是什么？（2）决定了Δ_μ_作用的关键因素是什么？（3）Δ_μ_对于双稳态性质是否存在更复杂的调控作用？
为了回答以上问题，基于包含正反馈的单PdP循环网络，以及包含正反馈的双PdP循环网络，该研究构建动力学模型并使用[ATP]-Δ_μ_相图来研究网络结构如何影响双稳态开关中的[ATP]和Δ_μ_的调控机制。
（1）对于单PdP循环网络，该研究通过理论分析和数值模拟表明，在Δ_μ_ > 0时，无论网络结构如何变化，双稳区边界的斜率始终为负值，说明动力学参数[ATP]和热力学参数Δ_μ_共同打开/关闭单PdP循环的双稳态开关，协同调控单稳态-双稳态跳转过程。
（2）对于双PdP循环网络，该研究通过解析计算和模拟证明了对于“同向”网络（网络中所有磷酸化都促进最终产物生成，图2a“identical”），双稳区边界的斜率都是负数，Δμ与[ATP]和总是协同调控双稳态性质。而对于“反向”网络（网络中至少有一个磷酸化反应使得目标分子减少，图2a“reversed”），双稳区边界斜率有各种选择（图2b）。尽管“反向”网络中磷酸化能量Δ_μ_只部分用于促进目标产物生成（能量利用率低于“同向”网络），但是研究也发现“反向”网络中Δ_μ_与[ATP]的竞争效应是有利于提高双稳态的鲁棒性。
图2. 双PdP循环网络及不同的双稳区类型。（a）具有“同向”和“反向”网络结构的双PdP循环网络。“磷酸化贡献”（Phosphorylation Contribution，PC）是该网络的所有磷酸化反应中，促进目标产物Sp生成的磷酸化反应占比。“反馈”（Feedback）是表征所有反馈类型的数组，其中+1和-1分别代表正反馈和负反馈。（b）[ATP]-Δ_μ_相图中四种双稳区类型的示意图。分类条件为双稳态区域边界斜率，例如NP（Negative-Positive）代表两条边界的斜率一正一负，Other则包含更复杂的双稳态区域。
该研究还发现在双PdP循环网络中可能存在三稳态行为（图3a和3b），且可能存在Δ_μ_对双稳态的复杂调控（图3d和3e）。首先，Δ_μ_对系统稳态数目的调控，产生了有趣的[ATP]- Δ_μ_相图，即三稳态区域嵌套在双稳态区域内（图3c）。分析表明基于目标分子Sp去磷酸化的负反馈调控是双PdP循环网络中三稳态产生的潜在机制。同时，该研究还发现了Δ_μ_对双稳态性质的非一致调控。通常而言，Δ_μ_的增加总是有利于双稳态鲁棒性提高（如图2b中NN、NP和PP）。然而，在图3f中，只有在特定Δ_μ_水平下，系统才能维持双稳态的存在，即在[ATP]- Δ_μ_相图中存在一个岛屿状的双稳态区域；当Δ_μ_从生理水平（Δ_μ_ ~ 23 kBT）开始增加时，双稳态却消失了。
图3. 双PdP循环网络中三稳态性质和∆μ对双稳区边界的复杂调控。（a-c）Network 2抽样结果中的三稳态现象。当自由能升高时，相同[ATP]下[Sp]的稳态数量从两个变为三个（b），使得系统从双稳态变成三稳态（c）。（d-f）在Network 7中发现的对双稳区非单调调控行为。
综上所述，该研究关注细胞内ATP水平（[ATP]）和细胞内ATP水解自由能（Δ_μ_）对细胞内基因调控网络双稳态性质的调控作用，揭示了在同向网络中，无论反馈机制如何，[ATP]和∆_μ_都以协同的方式来调控单-双稳态的跳转；在反向网络中，存在[ATP]和∆_μ_对双稳态性质的竞争调控，这种竞争效应可以增强双稳态的鲁棒性；本研究还讨论了具有三稳态特性和Δ_μ_非单调调控效应的特殊网络结构。在论文审稿过程中，审稿人对该研究的结果提出较高评价，部分审稿意见如下：“The points addressed here are of extreme importance in the study of biochemical switches and add a new dimension in these studies of this area”。
课题组从2018年开始，研究了细胞内非平衡态热力学对细胞内不同调控网络中动力学行为的影响并完成了一系列的工作[5-7]，主要研究成果包括：理论分析了非平衡态和随机性对芽殖酵母DNA损伤修复通路激活过程的影响[5]；在裂殖酵母中，结合理论分析和实验方法，揭示了ATP和Δ_μ_对细胞周期G2-M转换过程中双稳态开关的调控作用[6]；在胰岛β细胞中，分析了相关离子通道的热力学性质，解析了ATP和Δ_μ_对钙振荡行为的调控机制，并利用ATP-Δ_μ_相图解释了不同钙振荡行为的产生机制[7]。
北京大学物理学院李典杰为论文第一作者，北京大学物理学院/定量生物学中心李方廷副教授为通讯作者。该研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金等机构的支持。
参考文献：
[1] E. Schrödinger, What Is Life? The Physical Aspect of the Living Cell (The University Press, Cambridge, 1944).
[2] X. Yang, et al., Physical bioenergetics: Energy fluxes, budgets, and con straints in cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 118, e2026786118 (2021).
[3] U. Alon, An Introduction to Systems Biology: Design Principles of Biological Circuits. (Chapman & Hall/CRC, Philadelphia, PA, 2023).
[4] H. Qian, Phosphorylation energy hypothesis: Open chemical systems and their biological functions, Annu. Rev. Phys. Chem. 58, 113 (2007).
[5] C. Jin, X. Yan, and F. Li, Non-equilibrium and stochasticity influence the activation process of the yeast DNA damage pathway, Sci. China Phys. Mech. Astron. 61, 028721 (2018).
[6] D. Zhao, et al., Nonequilibrium and Nonlinear Kinetics as Key Determinants for Bistability in Fission Yeast G2-M Transition, Nonequilibrium and nonlinear kinetics as key determinants for bistability in fission yeast G2-M transition [q-bio.MN] arXiv:1610.09637.
[7] Y. Sun, et al., ATP hydrolysis kinetics and thermodynamics as determinants of calcium oscillation in pancreatic 𝛽 cells, Phys. Rev. Res. 4, 043142 (2022).
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